جمشید مشایخی دارای تحصیلات ناتمام در رشتهٔ تئاتراست. وی سال ۱۳۳۶ به استخدام اداره تازه تأسیس هنرهای دراماتیک درآمد و به عنوان بازیگر کار خود را در برنامه نمایشی کانال سوم غیردولتی آغاز کرد، اولین فعالیت هنری وی بازی در تلهتئاتر «بعد از سی سال» به کارگردانی علی نصیریان در سال ۱۳۳۹ بودهاست و با ایفای نقش در فیلم کوتاه «جلد مار» هژیر داریوش به همراه فخری خوروشجلوی دوربین رفت. او حتی به خاطر بازی سینمایی اش برای مدتی از کار تئاتر اخراج شد.در واقع کار حرفهای خود را از سال ۱۳۴۹ بهطور رسمی شروع کرد. بازی جمشید مشایخی در نقش انسانهای بیرحم و همچنین نقشهای تاریخی همچون «شازده احتجاب»،
«کمال الملک» و رضا تفنگچی/خوشنویس در سریال «هزار دستان» نشانگر از توانایی بازیگری اوست. او در سال ۱۳۶۳، بابت بازی در دو فیلم گلهای داوودی و کمالالملک، برندهٔ سیمرغ بلورین بهترین بازیگر نقش اول مرد جشنواره فیلم فجر شد. از نمایشهای مهم او بازی در نقش «بزرگ آقا» در نمایشمیراث کارِ بهرام بیضایی در تالار ۲۵ شهریور در آذر ماه ۱۳۴۶ بود.
مشایخی در سال ۹۳ به عنوان سفیر سلامت چشم و بینایی و در سال ۹۴ به عنوان سفیر سلامت از سوی وزارت بهداشت و دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تهران معرفی و به وی تندیس سلامت اهدا شد.
او پس از تحمل یک دوره بیماری در ۱۳ فروردین ۱۳۹۸ در سن ۸۴ سالگی در بیمارستان عرفان درگذشت.
پایگاه خبری آرت نیوز این واقعه تلخ را بر همه دوستداران او تسلیت عرض مینماید